齊瑤

研究難點

病毒是一種個體微小、結構簡單、只含一種核酸（DNA或RNA）、必須在活細胞內寄生并以復制方式增殖的非細胞型生物。而病毒侵染宿主細胞卻是一個非常復雜的過程，主要分為吸附（Attachment）、進入（Entry/Penetration）、復制（Replication）、大分子合成（Biosynthesis）、裝配（Assembly）、釋放（Release）等幾個階段，如圖1。

圖1.HIV病毒侵染人源細胞過程示意圖^[1]

如何從初始的吸附和進入階段進行干預阻斷，是病毒性疾病防治的切入點之一。以人類免疫缺陷病毒（HIV），也就是引發(fā)艾滋病的病原為例，它通過顆粒表面的包膜糖蛋白（Env）與免疫細胞表面的CD4分子、輔助受體互作，實現病毒與宿主細胞的融合、感染過程。科學家們曾運用BlaM（β-內酰胺酶分析：測量細胞群中病毒融合的技術）或細胞內病毒衣殼蛋白p24分析等多種方法對病毒的侵染過程進行檢測，但由于技術的限制，均不能直接實時監(jiān)測病毒進入宿主細胞的動態(tài)融合過程^[2]。因此，在時間和空間上都具備高靈敏度的FLIM-FRET，成為了該項研究的破冰技術。

FLIM-FRET

經常關注徠卡課堂的同學們，想必對FLIM-FRET都不陌生了。在這里，我們再簡單回顧一下幾個關鍵性的概念。

熒光壽命：熒光是指熒光分子吸收能量后，其處于基態(tài)（S₀）的電子躍遷至激發(fā)態(tài)（S₁），經過短暫停留，由激發(fā)態(tài)（S₁）再回到基態(tài)（S₀）時釋放出光的現象，而熒光分子停留在激發(fā)態(tài)的時間就是熒光壽命（圖2A）。與熒光光譜一樣，熒光壽命也是熒光物質的一種內在*性質。

FLIM（Fluorescence Lifetime Imaging，熒光壽命成像）：是一種基于熒光壽命的顯微成像技術，其成像結果提供像素位點的壽命信息（如圖2B），使得我們在熒光強度成像之外，能更加深入地對樣品進行功能性測量。熒光壽命成像具有不同于熒光強度成像的眾多優(yōu)點，如不受熒光物質濃度、光漂白、激發(fā)光強度等因素的影響。但會因為分子構象、分子間相互作用、分子微環(huán)境、生理狀態(tài)等條件改變而發(fā)生變化，因此熒光壽命可用于分析分子的這些變化，基于熒光壽命測量的FRET是FLIM的重要應用之一。

圖2. A. 熒光壽命示意圖；B. FLIM：提供每個像素位點的熒光壽命信息（左）；基于熒光壽命信息的細胞成像結果（右）

FRET（Fluorescence Resonance Energy Transfer，熒光共振能量轉移）：供體熒光基團（Donor）的發(fā)射光譜與受體熒光基團（Acceptor）的吸收光譜有一定的重疊，當供體被激發(fā)后，且兩個熒光基團間的距離小于10nm時，處于激發(fā)態(tài)的供體將把一部分或全部能量轉移給受體，使受體被激發(fā)，即發(fā)生熒光能量的非放射性轉移現象，為FRET（如圖3），這一過程也伴隨著供體熒光壽命的縮短和受體熒光壽命的延長。

圖3. FRET原理（左）^[2]及FRET實例（右）
（右）：用FLIM-FRET測量N1E-115 細胞膜上PH結構域的相互作用，發(fā)生FRET的細胞呈現較短的熒光壽命（偏綠），未發(fā)生FRET的細胞呈現較長的熒光壽命（偏紅）

FLIM-FRET兼具 FLIM 和 FRET 兩者的優(yōu)勢，不受熒光物質濃度、光漂白、激發(fā)光強度等因素的影響，且樣品制備簡單，測量結果準確性高，易重復。因此，FLIM-FRET非常適合于進行分子間相互作用、分子構象或生理狀態(tài)改變等的研究。

應用實例

那么科學家是如何將FLIM-FRET應用于監(jiān)測HIV病毒侵入宿主細胞的動態(tài)過程呢，讓我們看以下兩個實例：
（一）利用FRET生物傳感器示蹤HIV進入宿主細胞過程^[3]來自牛津大學的研究者設計了一個HIV-Chameleon生物傳感器，由一對能夠發(fā)生FRET的熒光團（mTFP1和eYFP）組成，兩個熒光團之間通過短肽序列（包含煙草蝕刻病毒TEV蛋白酶切割位點）鏈接在一起（如圖4A右）。TEV蛋白酶（TEVp）可以與HIV-1 Vpr蛋白或Gag蛋白融合，摻入病毒顆粒中。當包含TEV蛋白酶的病毒與表達生物傳感器的細胞融合時，Vpr-TEV或Gag-TEV（rTEV）被釋放到細胞質中，并特異性地裂解鏈接序列，增加mTFP1與eYFP之間距離至10nm以上，阻斷FRET，并可通過FLIM進行測量。圖4B為FLIM偽彩圖與圖像中所有像素的壽命直方圖，其中藍色表示較短的壽命（無融合），紅色表示較長的壽命（融合）。這樣就可以實時定量熒光壽命的改變，從而示蹤病毒與宿主細胞融合的瞬間動態(tài)過程。作者將所得結果與廣泛使用的BlaM分析結果比對，二者具有高度匹配性，因此，HIV-Chameleon生物傳感器與FRET-FLIM的結合使用，可以實現單個活細胞或群體的病毒融合動力學實時監(jiān)測。

圖4. HIV-Chameleon檢測病毒融合^[3]
A.（左）TEV蛋白酶（TEVp）與HIV-1 Vpr蛋白或Gag蛋白融合的兩種包裝過程；（右）HIV-Chameleon生物傳感器示意圖；B.病毒融合前后的熒光壽命成像（Scale Bar=30μm）
 

（二）細胞代謝水平對于HIV-1侵染宿主細胞的影響^[4]研究人員在HIV-1病毒的侵染機制研究中發(fā)現，病毒侵染過程中，宿主細胞代謝水平與膜狀態(tài)改變有關。將FRET生物傳感器瞬時轉染到細胞中（如圖5A），記錄瞬時表達這些生物傳感器的細胞的FLIM圖像，并進行BlaM分析，結果表明，乳酸濃度較高的單細胞與病毒融合性更高，此外，具有更高ATP/ADP比率的細胞與病毒的融合性更高（如圖5B）。也就是說，糖酵解通量較高的細胞更容易被HIV-1感染。
 

圖5. 單個細胞中的相對乳酸濃度和ATP / ADP比率與HIV-1融合相關^[4]；
（A）FRET生物傳感器;（B）同樣區(qū)域細胞的BlaM（上）和FLIM成像（下），白色實線所示為正在與病毒融合的細胞，在BlaM中呈紅色，熒光壽命較長，白色虛線所示為未融合的細胞，BlaM中呈綠色，熒光壽命較短

進一步的分析表明，2-脫氧-d-葡萄糖（2-DG）對糖酵解的靶向抑制作用大大降低了HIV-1的融合和感染。而用2-DG處理的細胞分別具有較低的膜膽固醇和較高的膜張力值。因此，作者構建了一種基于Ypet/eCFP FRET的膜張力感應器MSS，由一個彈性張力傳感模塊和兩個與脂分子連接的蛋白質組成，這兩個蛋白質錨定在質膜的Raft和非Raft區(qū)域，對膜張力變化非常敏感（如圖6）。通過FLIM測量單個細胞MSS張力探針瞬時表達，證實了HIV-1需要在膜張力較低的區(qū)域進入細胞，也進一步確定了宿主細胞糖酵解活性和膜張力之間的聯系，其在活細胞中的單病毒融合水平上實時影響HIV-1融合。

圖6.（左）靈敏型膜張力感應器MSS探針以及對照組非靈敏型感應器KMSS探針示意圖；（右）多種不同處理條件下，TZM-bl 細胞表達MSS的FRET效率成像^[4]

總結

FLIM-FRET提供了基于群體方法或光譜方法所難以實現的單細胞微環(huán)境中的分辨率，能以高時空分辨率在單個細胞中可視化和識別影響HIV-1感染的關鍵因素，實現單一病毒跟蹤技術。這對于在HIV-1感染早期階段尋找艾滋病的治療方法，有著重要的科學意義。

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